В 1538 году территория империи инков была покорена Эрнандо Писарро, братом завоевателя Перу. Испанцы основали здесь несколько поселений, эта область вначале называлась провинцией Чаркас, а позднее — Верхним Перу. В колониальный период на серебряных рудниках работали индейцы (пеоны), которые неоднократно восставали против испанцев. В течение почти 300 лет территория Боливия являлась составной частью испанской колониальной империи (с 1542 — в составе вице-королевства Перу, с 1776 — вице-королевства Ла-Платы) и носила название Верхнее Перу. На протяжении всего колониального периода, особенно в 16—17 вв., Верхнее Перу было одним из главных экономических центров испанской колониальной империи в Южной Америке. Серебряные рудники в Потоси являлись в то время наиболее крупными в мире. В рудниках трудились индейцы-митайосы, отбывавшие обязательную трудовую повинность. Более половины всех земель в Верхнем Перу было роздано королевским правительством Испании в качестве энкомьенд испанским колонистам; индейцы несли многочисленные повинности в пользу владельцев энкомьенд — энкомендеро. Социально-экономические отношения в Верхнем Перу представляли собой переплетение рабовладельческой и феодально-крепостнической форм эксплуатации. Индейцы упорно боролись против колониального порабощения. Наиболее крупным было восстание 1780—81 под руководством братьев Катари, однако оно, как и другие выступления индейцев, было жестоко подавлено.
В мае 1809 года произошло восстание в Чукисаке, которое было подавлено. 9 декабря 1824 году армия генерала Антонио Хосе де Сукре в битве при Аякучо победила испанцев и освободило территорию Боливии. Важным революционным этапом в истории Боливия явилась война за независимость (см. Война за независимость испанских колоний в Америке 1810—26). Во главе движения за независимость стояли патриотически настроенные круги креольской землевладельческой знати, нарождающейся торговой буржуазии и прогрессивная интеллигенция. Началом войны за независимость на территории Верхнего Перу явилось восстание в г. Чукисака, вспыхнувшее 25 мая 1809. Антииспанские восстания имели место также в гг. Кочабамбе, Ла-Пасе, Оруро, Потоси и др. Одним из выдающихся деятелей освободительного движения в Боливия был П. Д. Мурильо — председатель Революционной хунты, казненный после поражения восстания, начавшегося в Ла-Пасе в июле 1809. Позиции колонизаторов оказались в Верхнем Перу более прочными, чем в других районах вице-королевства Ла-Платы, и лишь в декабре 1824 освободительная армия под командованием генерала Сукре — сподвижника С. Боливара, одержала решающую победу при Аякучо и разгромила испанские войска. В августе 1825 конгресс в Чукисаке провозгласил создание самостоятельной независимой республики Боливии (названа в честь Боливара).